最近，知名美妝護(hù)膚品牌卷入成分爭(zhēng)議風(fēng)波。有博主質(zhì)疑稱(chēng)該品牌一款重組膠原蛋白精華的產(chǎn)品涉嫌造假，重組膠原蛋白真實(shí)添加量為0.0177%，且未檢測(cè)出膠原蛋白的核心氨基酸成分——甘氨酸。該公司聲明，產(chǎn)品成分標(biāo)注均按法定標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行并通過(guò)藥監(jiān)部門(mén)審核備案，不存在任何成分造假或隱瞞行為。雙方爭(zhēng)論的核心還在于檢測(cè)方法的不同。

重組膠原蛋白作為生物醫(yī)藥與護(hù)膚領(lǐng)域的高效活性原料，其真蛋白含量直接決定產(chǎn)品的功效與質(zhì)量，且氨基酸作為基本組成單元構(gòu)成重組膠原蛋白的鏈狀結(jié)構(gòu)，其特定序列與修飾（如羥脯氨酸）直接決定其三螺旋穩(wěn)定性及生物學(xué)功能。本文使用“凱氏定氮法"檢測(cè)重組膠原蛋白中的總氮、非蛋白氮及真蛋白含量，并使用“高效液相色譜法"檢測(cè)重組膠原蛋白中的氨基酸含量，為廣大生產(chǎn)企業(yè)、第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)及監(jiān)管部門(mén)提供支持。

根據(jù)《YY/T 1947-2025 重組膠原蛋白敷料》中要求，重組膠原蛋白含量可按照《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版 四部)通則0731蛋白質(zhì)含量測(cè)定法的“凱氏定氮法"進(jìn)行測(cè)定，采用鎢酸鈉沉降法沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，通過(guò)差減法減去樣品中非蛋白氮含量，從而得到真蛋白含量。

儀器

海能K1160全自動(dòng)凱氏定氮儀、SH420F石墨消解儀、分析天平等。

試劑

甲基紅、溴甲酚綠、硼酸、氫氧化鈉、無(wú)水硫酸鉀、五水合硫酸銅、濃硫酸、鎢酸鈉。

樣品

重組膠原蛋白修復(fù)液。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程

試劑配制完成后，進(jìn)行樣品稱(chēng)量。

樣品稱(chēng)量

1、總氮含量測(cè)試：通過(guò)減量法準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品5 g左右（精確至0.1 mg），并轉(zhuǎn)移至潔凈的消化管中。

2、非蛋白氮含量測(cè)試：通過(guò)減量法準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品5 g左右（精確至0.1 mg），置于20 mL容量瓶中，加入10 mL的純水、2 mL的10%鎢酸鈉溶液和2 mL的0.33 mol/L硫酸溶液，加水定容至刻度。搖勻，靜置30分鐘后，于3000 rpm下離心5 min以促進(jìn)樣品過(guò)濾。隨后取上清液進(jìn)行過(guò)濾，棄去初濾液（約5滴），取續(xù)濾液，使用10 mL移液管準(zhǔn)確量取10 mL濾液于消化管中待測(cè)。空白消化管中則需加入8 mL的純水、1 mL的10%鎢酸鈉溶液和1 mL的0.33 mo1/L硫酸溶液。

消解

向空白及樣品消化管中加入0.2 g硫酸銅、3 g硫酸鉀和10 mL濃硫酸后上機(jī)消解。消解程序如表1：

表1  SH420F石墨消解儀消解程序設(shè)置

蒸餾與滴定

待消解程序完成，消化管冷卻并無(wú)酸霧后，使用凱氏定氮儀進(jìn)行檢測(cè)，定氮儀參數(shù)設(shè)置如表2：

表2  K1160全自動(dòng)凱氏定氮儀試驗(yàn)參數(shù)設(shè)置

測(cè)試結(jié)果

樣品經(jīng)消解和上機(jī)測(cè)試，重組膠原蛋白產(chǎn)品中總氮、非蛋白氮及真蛋白含量如表3至表5所示：

表3  樣品中總氮含量表

表4  樣品中非蛋白氮含量表

表5  樣品中真蛋白含量表

注：表中真蛋白含量=（樣品總氮含量-非蛋白氮含量）×蛋白轉(zhuǎn)換系數(shù)（5.07）。

結(jié)論

經(jīng)測(cè)試，重組膠原蛋白產(chǎn)品中的總氮、非蛋白氮和真蛋白含量分別為0.3348 mg/g、0.1118 mg/g和1.1306 mg/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，凱氏定氮儀可用于檢測(cè)重組膠原蛋白產(chǎn)品中的真蛋白含量。

高效液相色譜法檢測(cè)氨基酸時(shí)，因氨基酸自身無(wú)紫外吸收基團(tuán)，需借助異硫氰酸苯酯（PITC）、鄰苯二甲醛（OPA）、丹磺酰氯（DNSCl）、2,4-二硝基氟苯（DNFB）等柱前衍生試劑引入生色基團(tuán)，使衍生物具備紫外吸收特性以便被檢測(cè)。異硫氰苯酯（PITC）作為氨基酸分析中的經(jīng)典柱前衍生試劑，通過(guò)與氨基酸的α-氨基特異性反應(yīng)生成穩(wěn)定的苯基硫代氨基甲酰（PTC）衍生物，該衍生物具有強(qiáng)紫外吸收特性（λmax=254nm），可顯著提升檢測(cè)靈敏度至皮摩爾級(jí)，同時(shí)其反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物穩(wěn)定性高且能兼容多數(shù)氨基酸（包括含羥基或含硫氨基酸），使其在高效液相色譜分析中成為兼顧靈敏度、選擇性與操作便捷性的理想選擇。本實(shí)驗(yàn)采用PITC柱前衍生-高效液相色譜法檢測(cè)重組膠原蛋白中的16種氨基酸。

儀器配置

悟空K2025高效液相色譜儀：K2025 P2二元高壓輸液泵、K2025 AS自動(dòng)進(jìn)樣器、K2025 CO柱溫箱、K2025 UVD紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器、Wookinglab色譜工作站。

色譜條件：

色譜柱：JinGuBang AAA ，4.6×250 mm，5 μm；

流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0.05 mol/L乙酸鈉水溶液，流動(dòng)相B為甲醇-乙腈-水=1:3:1，梯度洗脫如下表：

進(jìn)樣量：20 μL；

洗針液：90%甲醇水溶液；

柱溫：40℃；

檢測(cè)器及檢測(cè)波長(zhǎng)：檢測(cè)器為紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、線性范圍結(jié)果

按照色譜條件進(jìn)行采集，16種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示，積分結(jié)果如表1所示。

圖1  16種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

膠原蛋白含量的檢測(cè)方法多樣，具體選擇取決于樣本類(lèi)型、設(shè)備條件等，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件和需求選擇合適方法，必要時(shí)可結(jié)合多種技術(shù)驗(yàn)證結(jié)果。